Е. А. Кустова, Н. Т. Уразалиева, М. Г. Булегенова, К. И. Билялова,
Научный центр педиатрии и детской хирургии, г. Алматы

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – быстро развивающаяся технология, которая позволяет добиться успеха при лечении злокачественных заболеваний крови (лейкемии, лимфомы, миеломы) и других гематологических заболеваний (первичный иммунодефицит, апластическая анемия, миелодисплазия). Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) может быть аутогенной, при которой используют стволовые клетки самого пациента, выделенные из периферической крови, и аллогенной, когда используют костный мозг или пуповинную кровь донора.

Для проведения успешной трансплантации необходимо определение количества гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови и костном мозге, которое достаточно давно и подробно охарактеризовано иммунологически [1]. Иммунофенотипическая характеристика ГСК включает определение базисных характеристик стволовой клетки – светорассеяния лазерного луча, определяющего размер и степень гранулярности, а также уровней экспрессии CD34 и CD45 на мембране клеток пула ГСК. Известно, что клетки пула ГСК имеют низкие параметры бокового светорассеяния (SSC-low), то есть количество клеточных включений минимально [2].

Молекула CD34 является стадиеспецифичным антигеном, определяющим клетки ранних этапов дифференцировки. Показано, что при достаточной морфологической однородности CD34+ клетки гетерогенны по функциональным свойствам и уровню пролиферативной активности. Установлено, что по мере дифференцировки клетки от истинно стволовой (обладающей широким спектром возможностей к дифференцировке и пролиферации) до унипотентной (способной к дифференцировке только по одному ростку кроветворения) репопулирующая способность и потенциал пролиферации снижаются [3].

Известно, что уровень экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45 представлен на всех гемопоэтических клетках по-разному, по мере дифференцировки клеток его экспрессия нарастает. Сопоставление уровней экспрессии CD34 и CD45 позволяет идентифицировать ГСК в биологическом материале [4].

Целью данного исследования явился сравнительный анализ определения стволовых гемопоэтических клеток в процессе афереза.

В данной публикации приводятся результаты иммуноцитофлюориметрического исследования стволовых гемопоэтических клеток периферической крови и костного мозга, полученных в ходе ауто- и аллотрансплантаций в Научном центре педиатрии и детской хирургии, где в 2013 г. была освоена и внедрена трансплантация гемопоэтических стволовых клеток с целью улучшения лечения онкогематологических и других заболеваний. Всего было проведено 11 ауто- и 3 аллотрансплантации.

Аллотрансплантацию проводили детям с острым лимфобластным лейкозом, острым миелобластным лейкозом, миелодиспластическим синдромом; аутотрансплантацию – детям с лимфомой Ходжкина, нейробластомой, ретинобластомой.

Материалы и методы

Пробоподготовка для выявления ГСК в периферической крови и костном мозге осуществлялась при помощи двухплатформенного метода по принципу окрашивание-лизис- отмывка. Клетки (не менее 2–3×106/мл) были окрашены в течение 15 минут CD45 FITC, CD34 PE из набора Ste

m Cell Enumeration Kit. Для лизирования эритроцитов был внесен раствор Ammonium Chloride Lysing Solution, подготовленный согласно рекомендациям производителя. Далее был добавлен 7-AAD (7-амино-актиномицин D) для окрашивания нежизнеспособных клеток. Клетки были анализированы на проточном цитометре FacsCanto II в течение часа.

Разработанный алгоритм получения и анализа данных включал:

— определение содержания ядросодержащих событий,
— идентификация кластера CD45+ событий на проточном цитофлюориметре,
— при помощи специальной функции цитометра из анализа исключаются нежизнеспособные клетки 7-AAD+,
— гейтирование кластера CD45+CD34+ позитивных событий по параметрам светорассеяния осуществляется на основе живых ЯСК (ядросодержащих клеток).

Абсолютное количество стволовых гемопоэтических клеток рассчитывалось на основании показателей относительного количества CD45+CD34+ клеток, объема полученного образца и массы тела реципиента. Многолетний опыт трансплантаций костного мозга и периферической крови за рубежом свидетельствует о том, что для успешного восстановления кроветворения необходимо собрать не мен

ее 3×106/кг CD34+ ГСК. Это является ключевым моментом для исхода трансплантации [5].

Результаты и обсуждение

Для определения ГСК мы использовали двухплатформенный метод, который, на наш взгляд, является наиболее удобным и точным. Он включает в себя определение ЯСК на гематологическом анализаторе и цитофлюориметрическое описание параметров CD34+ клеток. В последующем просчитывается абсолютное количество стволовых клеток, позволяющих судить о достаточном их количестве в каждом конкретном образце.

Относительное содержание CD45+ событий было оценено при исследовании образцов, окрашенных антителами FITC. Всего собиралось не менее 500 тыс. событий, в гейте CD45+CD34+ – не менее 100. При концентрации ЯСК в образце более 100×109/л образец разводится в определенных соотношениях (рис. 1, 2, 3).На этапе замораживания с целью сохранения выделенных в ходе трансплантации ГСК к ним добавлялся клеточный криопротектор диметилсульфокскида (ДМСО). Это позволяет максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток (ЯСК). Далее пакеты с ГСК поместили в специальные дюары для хранения при t=-180°С. После размораживания образцы снова подвергались проверке на количество ГСК перед введением пациенту.

Данные по определению относительного и абсолютного количества стволовых CD34 гемопоэтических клеток представлены в таблицах 1, 2.Как показано в таблицах 1, 2, средний процент CD34+ в образцах при аутологичных трансплантациях с добавлением клеточного криопротектора ДМСО составил 2,8±0,3, костного мозга – 2,7±0,7. В пересчете на абсолютные значения (на кг массы тела) это составило 6,1±1,0 и 2,7±2,5 соответственно. В среднем, как показано в таблицах 1, 2, количество ГСК было достаточным как при ауто-, так и при аллотрансплантациях.Только в одном случае аутотрансплантации было собрано недостаточное количество ГСК, что выражалось как в низком относительном количестве (1,0%), так и в недостаточном содержании CD34 на кг массы тела пациента (1,4×106/кг).

Выводы

Таким образом, включение протокола определения количества CD34+ клеток в процедуру ауто- и аллотрансплантации позволяет оценить количественное содержание малоклеточной популяции ГСК в продукте афереза.

В ходе проведения методики определения CD34 использовались параметры точной верификации ГСК путем иммунофлюоресценции в образце:

— светорассеяние лазерного луча: показатель бокового светорассеяния для них всегда низкий SSC-low, то есть оптическая плотность клеточной цитоплазмы невысока, а количество клеточных включений минимально;
— более низкий уровень экспрессии CD45 антигена на стволовых клетках по сравнению с уровнем их на зрелых лимфоцитах.

Общепринятым для успешной трансплантации считается количество CD34+ клеток не менее 3×106/кг CD34+, следовательно, в ходе проведения процедур ауто- и аллотрансплантации ГСК у детей было получено достаточное количество CD34+ клеток. Для успешной трансплантации главное – содержание CD34 в аферезном продукте, но не содержание ЯСК, то есть предиктором качества запланированного афереза является сбор достаточного количества ГСК с целью дальнейшего введения их пациентам.

У всех пациентов после ГСК получен хороший клинический эффект. Однако количество стволовых клеток, инфузируемых пациенту при ауто- и аллотрансплантации не является единственным условием, определяющим успешность трансплантации. Большое значение имеют режим кондиционирования, возраст пациента, степень совместимости по системе HLA донора и реципиента и ряд других факторов.

Литература
1. Андреева Л.Ю., Тупицын Н.Н. Субпопуляции периферических стволовых гемопоэтических клеток (ПСГК). Проточно-цитофлюориметрическая идентификация ПСГК на основании светорассеяния, экспрессии CD34, CD45, AC133. / Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2002. – Т. 1. — No 1. – С. 60–65.
2. Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. Субпопуляции трансплантируемых стволовых кроветворных клеток / ж-л Онкогематология. – Т. 08. – No 1. – 2006. – С. 65–71.
3. Зубаровская Л.С., Фрегатова Л.М., Афанасьев Б.В. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при гемобластозах / Клиническая онкогематология: Руководство для врачей/ п/р профессора М.А. Волковой. – М. – Медицина. – 2007. – С. 912.
4. Зуева Е.Е., Куртова А.В., Русанова Е.Б., Горчакова М.Б., Слободнюк К.Ю. Количественный учет гемопоэтических стволовых клеток / Проточная цитометрия в медицине и биологии. – Алматы. – 2011. – С. 261.
5. Масчан А.А., Румянцев А.Г. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. – М.: Мед. информ. Агентство. – 2003.