Н. Н. Беляев, д. б. н., профессор, заведующий лабораторией
молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии
Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина КН МОН РК

Клеточные и молекулярные механизмы аутоиммунных процессов в организме, приводящих к возникновению и развитию тяжелых инвалидизирующих аутоиммунных болезней, представляют собой не только научную, но и глобальную медико-социальную проблему ввиду того, что эти заболевания на сегодняшний день остаются неизлечимыми, несмотря на значительные успехи современной клинической иммунологии. В настоящее время принято считать, что аутоиммунный патологический процесс возникает из-за реакций Т-лимфоцитов и антител, производимых В-клетками, с эпитопами собственных антигенов. В основе этого явления лежит срыв иммунологической толерантности к своему. Различают центральную и периферическую толерантность.

Установлено, что центральная толерантность связана с механизмами апоптопической гибели созревающих Т- и В-лимфоцитов в тимусе и костном мозге (соответственно), способных с высокой аффинностью распознавать аутоантигены в составе молекулы главного комплекса гистосовместимости, презентируемые эпителиальными и дендритными клетками тимуса и костного мозга. В итоге из тимуса поступают в кровоток, а через него в селезенку и лимфоузлы, зрелые Т-клетки хелперного (CD4+) и цитотоксического (CD8+) направления, а из костного мозга В-клетки, не способные распознавать собственные антигены. Поскольку предшественники Т- и В-лимфоцитов постоянно генерируются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, клональная селекция осуществляется непрерывно в течение всей жизни.

Однако в силу того, что не все аутоантигены могут быть представлены в тимусе, не все аутореактивные Т-клетки элиминируются центральными механизмами толерантности. Этот недостаток исправляется механизмами периферической толерантности. Механизмы эти большей частью являются гипотетическими. Тот факт, что у всех людей в сыворотке крови в малых количествах в норме присутствуют аутоантитела, взаимодействющие с ДНК, компонентами цитоскелета, миелином, сывороточным альбумином, тиреоглобулином, цитохромом с, коллагеном, трансферрином и другими клеточными белками, свидетельствует о том, что само по себе наличие аутоиммунного состояния еще не определяет развитие аутоиммунного заболевания. Поэтому иммунологи пришли к заключению, что в развитии аутоиммунных процессов важную роль играют нарушения регуляции иммунной системы, контролирующей периферическую толерантность.

Как известно, иммунная система контролируется рядом регуляторных клеток иммуносупрессорного характера, среди которых выделяют макрофаги второго типа, толерогенные дендритные клетки, миелоидные предшественники, мезенхимальные стволовые клетки, а также несколько субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, Тh3, Тr1, NKT и CD8+ клетки).

На основании литературных данных, а также ряда собственных исследований, нами была предложена гипотеза репаративно-иммунологического надзора, осуществляемого циркулирующими миелоидными предшественниками, которая поясняет сохранение аутотолерантности после тканевого повреждения.

В случае нарушения целостности какой-либо ткани в поврежденном очаге начинают образовываться факторы, такие как SDF-1, вызывающие мобилизацию из костного мозга миелоидных предшественников в область повреждения, где эти клетки осуществляют репарацию поврежденной ткани путем стимуляции тканевых стволовых клеток. Одновременно они секретируют супрессорные факторы, формирующие локальную зону иммуносупрессии, которая в данном случае необходима для предотвращения местного воспаления, препятствующего репарации. Кроме того, миелоидные предшественники опосредуют формирование иммунологи- ческой толерантности к образовавшимся в результате тканевого повреждения аутоантигенам, через активацию так называемых Т-регуляторных клеток (Treg), которые, в свою очередь, блокируют действие аутореактивных клонов Т- и В-лимфоцитов.

Нами было проведено исследование миелоидных предшественников и разработана методика их выделения из костного мозга в эксперименте на мышах. Были использованы сложные градиенты плотности перкола, на которых костный мозг разделяли на несколько фракций. Примечательной оказалась фракция с плавучей плотностью 1,09 г/мл, из которой были получены еще 3 фракции, различные по плотности. Они оказывали супрессорный эффект на пролиферацию любых делящихся клеток. В качестве тест-объекта таких супрессорных клеток была использована линия опухолевых клеток.

Такой подход в дальнейшем был использован для клеток крови человека. Оказалось, что фракции, которые мы обозначили как натуральные супрессорные клетки NS1, NS2 и NS3, реагировали на различные индукторы. В частности, NS1 – на интерлейкин-2, гистамин и интерферон-γ, NS2 – на интерлейкин-3 и ГМ-КСФ, NS3 – на интерлейкин-2 и ГМ-КСФ.

Разработанный методологический подход мы использовали при изучении иммуносупрессорной активности различных фракций миелоидных предшественников перифери- ческой крови здоровых доноров и больных ревматоидным артритом. В исследование были включены 15 больных, имеющих длительный стаж заболевания. Были ис- следованы клетки фракции с плотностью 1,09 на способность вызывать торможение пролиферации клеток опухолевой линии. Оказалось, что в сравнении с донорами, у которых индекс супрессии был невелик (не более 5–10%), у подавляющего большинства больных он был практически равен нулю. Однако у трех из них индекс супрессии, напротив, был значительно выше, чем у здоровых доноров, что послужило основанием предположить у них наличие хронического инфекционного процесса, при котором повышенная активность супрессорных миелоидных предшественников в литературе описана. Данные больные были обследованы на наличие у них бруцеллеза.

В результате проведенного клинического, эпидемиологического и лабораторного анализа (агглютинирующие антитела, антигенсвязывающие лимфоциты бруцеллезной специфичности) у 2 из 3 исследуемых больных обнаружилась хроническая форма суставного бруцеллеза, в связи с чем была назначена соответствующая антибиотикотерапия.

Таким образом, данный пилотный эксперимент показал, что в сложных случаях больных с хроническим ревматоидным артритом следует обследовать на возможность наличия другой патологии. Понятно, что метод, применяемый нами, неприемлем для обычной клинической лаборатории в связи с использованием культивирования клеток, требующего специального оборудования и соответствующей квалификации персонала. Поэтому мы предлагаем модифицировать наш метод с использованием клинического оборудования и коммерческих наборов реагентов, доступных для медиков.

В настоящее время в мировой литературе исследуемые нами миелоидные предшественники получили официальное название «миелоидных супрессорных клеток», или МDSC. Алгоритм усовершенствования теста на активность MDSC с помощью проточной цитометрии должен выглядеть следующим образом. Периферическую кровь разделяют на двухступенчатом градиенте перкола для получения фракции с плавучей плотностью 1,09 г/мл, затем полученные клетки метят флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам MDSC (CD34+, CD15+) и внутриклеточному цитокину – трансформирующему рост фактору бета (TGFβ), после чего эти клетки определяют с помощью проточной цитометрии. TGFβ является основным супрессорным фактором MDSC. Если процент CD34+CD15+ TGFβ равен нулю, то мы имеем дело с истинно аутоиммунным заболеванием. Если же доля этих клеток существенно превышает 10%, следует заняться поиском хронического инфекционного процесса.

Следующий аспект нашей работы, связанный также с аутоиммунной патологией, был направлен на изучение другой популяции клеток, так называемых Т-регуляторных клеток, или Трегов. В настоящее время Треги рассматривают в качестве основных виновников срыва периферической иммунологической толерантности к своему при аутоиммунной патологии. Эти клетки имеют характерный фенотип (CD4+CD25+) активированных Т-хелперов, но с обязательным включением внутриклеточного белка FoxР3+, являющегося транскрипционным фактором, ответственным за экспрессию ряда генов, приводящих к супрессорной активности.

На сегодняшний день установлено, что Треги участвуют в контролировании различных иммунологических процессов, включая аутоиммунные болезни, аллергию, микробные инфекции, противоопухолевый иммунитет, органную трансплантацию, фетальную материнскую толерантность, а также ожирение. Дефект функции Трегов может привести к развитию аутоиммунной болезни, а гиперактивность приводит к супрессии противоопухолевого иммунитета и развитию опухоли.

Мы попытались оценить, насколько определение простого содержания этих клеток в крови способно облегчить обнаружение различия между аутоиммунными больными, в частности с ревматоидным артритом, и здоровыми людьми.
С помощью проточной цитометрии были проанализированы клетки с фенотипами CD25/FoxР3+ или CD4/FoxР3+. Однако никакой разницы по количеству этих клеток в периферической крови здоровых доноров и аутоиммунных больных обнаружить не удалось. Поэтому мы решили найти способ определения активности Трегов, используя некий маркер, позволяющий дать их функциональную оценку. В качестве такого маркера мы использовали рецептор для высокомолекулярного гиалуронана CD44.

Гиалуронан – это обязательный компонент межклеточного матрикса, специфически связывающийся с молекулой адгезии CD44. Существуют только 2 изоформы молекулы CD44+, способные связывать гиалуронан, – V6 и V9. Поэтому наличие этого маркера на поверхности клеток еще не говорит о том, что клетка связывает гиалуронан. Поскольку Треги попадают в ткань с высоким содержанием гиалуронана, следовало изучить диагностическое значение таких клеток при определении их наличия в периферической крови.

Мы разработали алгоритм манипуляций периферической кровью, позволяющий оценить функциональное состояние Трегов. Из периферической крови выделяли мононуклеарную фракцию центрифугированием на градиенте фикол-изопака и подвергали негативной иммуномагнитной сепарации с целью выделения CD4+ Т-клеток, которые затем инкубировали совместно с антибиотиновыми парамагнитными бусами, содержащими антитела к биотину и биотинированный высокомолекулярный гиалуронан. В результате происходило мечение определенной части клеток магнитными бусами. Далее суспензию клеток пропускали через магнитный сепаратор. В результате были получены 2 фракции CD4+ Т-клеток, одна из которых связывала гиалуронан, а другая – нет (ГА+ и ГА– клетки). Эти фракции анализировали с помощью проточной цитометрии на содержание CD4+CD25+FoxР3+ клеток. При сравнительном анализе периферической крови здоровых доноров и больных ревматоидным артритом мы установили, что уровень содержания ГА+ Трегов у больных был выше, чем у здоровых. Значение полученного факта предстоит еще выяснить, но уже сейчас мы предполагаем усовершенствовать данную методику с целью ее упрощения. Для этого предполагается использовать коммерческий набор для выделения очищенных Трегов с фенотипом CD4+CD25+CD127- с помощью иммуномагнитной сепарации с последующей инкубацией выделенных клеток с FITC-меченным гиалуронаном и флуоресцентными антителами к FoxР3+. Далее с помощью проточной цитометрии следует определять клетки FoxР3+ГА+, по увеличению уровня которых можно судить о наличии аутоиммунного процесса.

Разработанные нами новые подходы позволят улучшить специфическую дифференциальную диагностику аутоиммунных заболеваний, тем самым внести вклад в практическое здравоохранение, а для фундаментальных исследований молекулярных и клеточных механизмов развития аутоиммунитета предоставят новые перспективные методологические инструменты.