Локшин В. Н., Карибаева Ш. К., Валиев Р. К., Малик А., Рыбина А.Н., Международный клинический центр репродуктологии «PERSONA», Казахстан, Алматы.

 

В статье представлены результаты исследования 99 супружеских пар проходившие программы IVF+CGH и FET, в результате которого было получено 282 эмбриона, у которых была произведена биопсия с дальнейшим исследованием полученного материала методом аrray-CGH с целью диагностики хромосомных нарушений до момента его имплантации в полость матки. Выведена взаимосвязь между уровнем АМГ и вероятностью получение эуплоидного эмбриона. Так при среднем АМГ в группе до 35 лет 4,79+ 2,2 – уровень эуплоидии составил 54,2%, а при уровне АМГ 2,98 + 2,9 в группе старше 36 лет – уровень эуплоидии эмбрионов – 43,7%. По результатам исследования мы получили беременность в 1 группе 57,1% (8), во 2 группе 64,5% (20).

Низкая эффективность вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) может быть результатом самых различных факторов (возраст старше 38 лет, нарушение  процесса имплантации, морфологические  и генетические особенности эмбриона). Практически все современные репродуктологи считают, что одной из основных причин  неудач программы ЭКО является возраст пациентов, при этом старении гамет приводит развитию эмбриона с хромосомной патологией  (анеуплоидии)  (2). Анеуплоидия напрямую связана с возрастом матери и лишь редко обусловлена  морфологическими характеристиками эмбрионов (3). Таким образом, очень часто даже «самые идеальные» эмбрионы, выбранные для переноса, будут анеуплоидными и не дадут наступление беременности (4).

По данным литературы  0,5% — 25 % пар с репродуктивным проблемы имеют сбалансированные перестройки хромосом (1-3). Преимплантационный генетический скрининг (PGS) после IVF в сочетании с пренатальным генетическим тестированием должен быть предложен парам с высоким риском получения хромосомных заболеваний у детей (4-7).

PGS эмбрионов применяется для диагностики хромосомных перестроек и выбора сбалансированных или здоровых эмбрионов и, таким образом, может приводить к более высоким показателям беременности и предотвратить передачу несбалансированных перестроек к потомству. Чтобы обнаружить хромосомные перестройки, выделены несколько методов молекулярной цитогенетики (8-11).

В течение многих лет использовалась методика флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), применялась на отдельных клетках, таких как полярные тела или бластомеры, которые были получены с помощью биопсии из ооцитов или эмбрионов на стадии деления. FISH, несмотря на широкое использование многими клиниками во всем мире, имел недостатки, в виде точности и согласованности теста PGD (12, 13). Более того, было показано, что эмбрионы на этих ранних стадиях часто имеют анеуплоидный мозаицизм, и поэтому результаты могут не соответствовать их истинному генетическому статусу (14-21). Последние успехи в амплификации всего генома (WGA), дают более надежные и эффективные методы молекулярного исследования для PGD, один из таких методов  — сравнительная геномная гибридизация (CGH), однонуклеотидный полиморфизм (SNP), кариомапирование и массивное параллельное секвенирование (12,13). В отличие от FISH, эти методы позволяют выполнять комплексный хромосомный скрининг (CСS) (16,20). Это означает, что сочетанный протокол PGD может использоваться для диагностики большинства типов транслокаций, что делает ненужным специфическое использование FISH для диагностики отдельных пар хромосом. Еще одна важная эволюция в PGD-это время биопсии эмбрионов. Недавние исследования, подтвердили, что биопсия трофоэктодермы (TE) является более лучшей методикой по сравнению с биопсией бластомера и имеет большую вероятность имплантации в циклах переноса эмбриона. (15). Кроме того, TE биопсия менее вредна для эмбриона, чем биопсия бластомера и позволяет исследовать больше клеток, что приводит к более точной генетической диагностике (17,18,19). Более того, прогресс в протоколах криоконсервации позволил проводить перенос эмбрионов в нестимулированном естественном или модифицированном менструальном цикле что приводит к более высокой вероятности имплантации (14,21).

Цель исследования

Установить значение сравнительной геномной гибридизации (аrray-CGH) в предимплантационном генетическом скрининге (PGS) у эмбрионов пациенток старшей возрастной группы в циклах криопереноса. Определить взаимосвязь уровня АМГ и вероятности получения анеуплоидных эмбрионов.

Материалы и методы

В период с ноября 2016г по сентябрь 2017г на базе международного клинического центра репродуктологии «PERSONA» было проведено ретроспективное открытое сравнительное исследование 99 супружеских пар, у которых было получено 282 эмбриона в программах ВРТ. Все супружеские пары проходили программы IVF и FET (с подготовкой эндометрия эстрогенами и формированием 2 фазы цикла микронизированным прогестероном).У эмбрионов проводилось биопсия трофоэктодермы на 5-й день или 6 день развития с амплификацией всего генома с последующем проведением метода а-CGH с целью диагностики хромосомных нарушений. Для дальнейшего исследования 99 женщин были разделены по возрастам на 2 группы. Первую группу (до 35 лет, средний возраст 29,7+ 2,4 лет), составили 32 женщины, во 2 группе 36 лет и старше(средний возраст 41,6 + 3,4 лет) было 67 пациенток

Результаты исследования

В результате исследования в 1 группе было выбрано 85 эмбрионов, во второй группе (старше 36 лет) 197 эмбрионов, (диаграмма1). В среднем количество ооцитов на 1 пациентку в 1 группе выходило по 14,4± ооцитов, во второй группе 8,2 ооцитов. Средний выход бластоцист на 1 пациентку составил 2,6±1,4 и 2,9±0,5 в 1 и 2 группе соотнесенно, но нужно учитывать тот факт, что во 2 группе старше 36 лет среднее количество протоколов ССО было 1,2 – для получения достаточного количества ооцито/бластоцист. Тогда как в группе до 35 лет среднее количество протоколов ССО было1,0.

Диаграмма 1

Так же мы обнаружили хромосомные аномалии у эмбрионов обеих групп: 39 (45,8%) в группе до 35 лет (эуплоидные — 46 (54,2%)) и в группе старше 36 лет — 111 (56,3%) (эуплоидные — 86 (43,7%)). В структуре хромосомных аномалий по группам статистически достоверной разницы не наблюдалось: анеуплоидии по типу трисомии диагностированы в 28,2% и 31,5% соответственно; анеуплоидии по типу моносомии составили 20,5% и 24,3%; хромосомные аберрации Dup–17,9% и 14,4%; хромосомные аберрации Del – 15,3% и 10,8%; хромосомные аберрации Del и Dup – 17,9% и 18,9%. Отмечена статически достоверная корреляционная взаимосвязь между уровнем АМГ и вероятностью получение эуплоидного эмбриона. Так при среднем АМГ в группе до 35 лет 4,79+ 2,2 – уровень эуплоидии составил 54,2%, а при уровне АМГ 2,98 + 2,9 в группе старше 36 лет – уровень эуплоидии эмбрионов – 43,7%.(диаграмма 2)

Диаграмма 2

По результатам нашего исследования мы получили беременность у 8 пациенток 1 группы, что составило 57,1%, во 2 группе беременность наступила у 20 женщин, что составило 64,5%. Отрицательный результат первой группе имел место в 42,8% (6 пациенток), во 2 группе у 11 женщин, что составило 35.4% (диаграмма 3).

Диаграмма 3

Таким образом, использование биопсии трофоэктодермы на стадии бластоцисты является важным моментом в лечении бесплодия пациентов старше 36 лет при проведении IVF. Преимплантационный генетический скрининг позволяет увеличить вероятность наступления беременности до 65% на перенос эмбриона, избавляет пациентов от переноса заведомо бесперспективных эмбрионов и не нужных ожиданий «чуда». A-CGS диагностика позволяет уменьшить риск рождения ребенка с хромосомной патологией с вероятностью до 95%. Существует прямая зависимость между уровнем АМГ пациентки и вероятностью получения эуплоидного эмбриона и соответственно рождения здорового потомства.

Литература
  1. Franasiak, M.D.,a Eric J. Forman, M.D.,a,b Kathleen H. Hong, M.D.,a,b Marie D. Werner, M.D.,a,b Kathleen M. Upham, B.S.,b Nathan R. Treff, Ph.D.,a,b and Richard T. Scott Jr., M.D.a,b « The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening» 2013
  2. Scott RT, Miller KA, Olivares R, Su J, Fratterelli J, Treff NR. Microarray based 24 chromosome preimplantation genetic diagnosis (mPGD) is highly predictive of the reproductive potential of human embryos: a prospective blinded non-selection trial. Fertil Steril 2008;90(Suppl):S22–3
  3. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet 2001;2:280–91.
  4. . Fragouli E, Wells D. Aneuploidy in the human blastocyst. Cytogenet Genome Res 2011;133:149–59.
  5. Treff NR, Su J, Tao X, Levy B, Scott RT. Accurate single cell 24 chromosome aneuploidy screening using whole genome amplification and single nucleotide polymorphism microarrays. Fertil Steril 2010;94:2017–21
  6. Christodoulos Christodoulou, M.Sc.,a Annelies Dheedene, M.Sc.,b Bjorn Heindryckx, Ph.D., € a Filip van Nieuwerburgh, Ph.D.,c Dieter Deforce, Ph.D.,c Petra De Sutter, M.D., Ph.D.,a Bjorn Menten, Ph.D., € b and Etienne Van den Abbeel, Ph.D.a « Preimplantation genetic diagnosis for chromosomal rearrangements with the use of array comparative genomic hybridization at the blastocyst stage» 2016
  7. Alfarawati S, Fragouli E, Colls P, Stevens J, Gutierrez-Mateo C, Schoolcraft WB, et al. The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertil Steril 2011;95:520–4.
  8. Munne S, Sandalinas M, Escudero T, Fung J, Gianaroli L, Cohen J. Outcome of preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertil Steril 2000;73: 1207–18.
  9. Malmgren H, Sahlen S, Inzunza J, Aho M, Rosenlund B, Fridstrom M, et al. € Single cell CGH analysis reveals a high degree of mosaicism in human embryos from patients with balanced structural chromosome aberrations. Mol Hum Reprod 2002;8:500–10.
  10. Munne S, Alikani M, Tomkin G, Grifo J, Cohen J. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities. Fertil Steril 1995;64:382–91.
  11. Verlinsky Y, Evsikov S. Karyotyping of human oocytes by chromosomal analysis of the second polar bodies. Mol Hum Reprod;5:89–95
  12. Handyside AH, Harton GL, Mariani B, Thornhill AR, Affara N, Shaw M-A, et al. Karyomapping: a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes. J Med Genet 2010;47:651–8.
  13. Deleye L, Dheedene A, De Coninck D, Sante T, Christodoulou C, Heindryckx B, et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertil Steril 2015;104:1276–85.e1.
  14. van Landuyt L, Stoop D, Verheyen G, Verpoest W, Camus M, van de Velde H, et al. Outcome of closed blastocyst vitrification in relation to blastocyst quality: evaluation of 759 warming cycles in a single-embryo transfer policy. Hum Reprod 2011;26:527–34.
  15. Adler A, Lee HL, McCulloh DH, Ampeloquio E, Clarke-Williams M, Wertz BH, et al. Blastocyst culture selects for euploid embryos: comparison of blastomere and trophectoderm biopsies. Reprod Biomed Online 2014;28:485–91.
  16. Colls P, Escudero T, Fischer J, Cekleniak NA, Ben-Ozer S, Meyer B, et al. Validation of array comparative genome hybridization for diagnosis of translocations in preimplantation human embryos. Reprod Biomed Online 2012; 24:621–9.
  17. Scott RT, Upham KM, Forman EJ, Zhao T, Treff NR. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril 2013; 100:624–30.
  18. Dimitriadou E, van der Aa N, Cheng J, Voet T, Vermeesch JR. Single cell segmental aneuploidy detection is compromised by S phase. Mol Cytogenet 2014;7:46.
  19. de Vos A, Staessen C, de Rycke M, Verpoest W, Haentjens P, Devroey P, et al. Impact of cleavage-stage embryo biopsy in view of PGD on human blastocyst implantation: a prospe
  20. Idowu D, Merrion K, Wemmer N, Mash G. Pregnancy outcomes following genetic diagnosis in couples with balanced reciprocal or robertsonian translocations. Fertil Steril 2015;103:1037–42.

van Landuyt L, Verpoest W, Verheyen G, de Vos A, van de Velde H, Liebaers I, et al. Closed blastocyst vitrification of biopsied embryos: evaluation of 100 consecutive warming cycles. Hum Reprod 2011;26:316–22.